Betrokken en zorgvuldig - Kennis maakt ons beter

Inhoud

Next generation sequencing (NGS) is het massaal parallel sequencen van DNA. Dit kan op verschillende platforms en de afdeling Klinische Genetica van het VUmc beheert twee HiSeq2500 en een MiSeq van Illumina. Deze machines zijn op dit moment een van de meest gebruikte machines op het gebied van NGS.

HiSeq2500
Op de HiSeq2500 zijn twee run opties mogelijk:

RAPID
De RAPID flow cell bevat twee lanen. Per laan wordt tussen 100 en 140 miljoen reads passing filter geproduceerd. Het is mogelijk om op beide lanen een uniek sample te runnen, in dit geval gebeurt clustering mbv de cBot.
Daarnaast is het ook mogelijk om 1 sample op beide lanen te runnen, hierbij gebeurt de clustering op de HiSeq2500 (on board clustering genoemd).
Met de RAPID flow cell gebruiken we de v2 chemie. Hierbij is het mogelijk om maximaal 2x250 bp te sequencen in 60 uur.

High Output
De High Output flow cell bevat 8 lanen. De clustering gebeurt altijd mbv de cBot, zodat op iedere laan een uniek sample zit.
Het is mogelijk om versie 3 en versie 4 chemie te runnen:

  • Versie 3 chemie levert gemiddeld per laan 175miljoen reads passing filter op. De maximale run lengte is 2x100 bp en duurt maximaal 11 dagen.
  • Versie 4 chemie levert gemiddeld per laan tussen de 200 en 250 miljoen reads passing filter op. De maximale run lengte is 2x125 bp en duurt maximaal 6 dagen.

MiSeq
De MiSeq is een kleinere sequencer dan de HiSeq2500, de bijbehoorde flow cell bevat slechts 1 laan. Op de MiSeq kunnen twee verschillende versies chemie gedaan worden:

  • Versie 2 chemie levert maximaal 15M reads per flow cell. De maximale run lengte is 2x250 bp en duurt 39 uur.
  • Versie 3 chemie levert maximaal 25M reads per flow cell. De maximale run lengte is 2x300 bp en duurt 56 uur.

Pipeline
Om de sequence data te analyseren heeft de afdeling Klinische Genetica een eigen pipeline ontwikkeld. De pipeline start direct na het demultiplexen van de data met het genereren van een kwaliteitsrapport met de ruwe data per sample. Als de kwaliteit aan de eisen van de klant voldoet, zullen we verder gaan met de analyse. Voor de analyse van humane DNA samples bevat de pipeline meerdere tools die de reads tegen het referentie genome mappen. Verder worden duplicaten gemarkeerd, local realignment toegepast, de base-kwaliteit herberekend en met behulp van filters SNPs en indels gedetecteerd. De laatste stap is het annoteren van de varianten zodat een overzicht van de meest waarschijnlijke kandidaten ontstaat.
 
Projecten
Enkele voorbeelden van projecten die we momenteel runnen op de HiSeq2500s en MiSeq en waarvoor we een pipeline ontwikkeld hebben zijn Non-invasive prenatal testing (NIPT), targeted sequencing and exome sequencing.
 
Verder runnen we op de Hiseq2500 verschillende projecten gedraaid zoals:

  • Whole Genome Sequencing
  • Bisulphite sequencing
  • miRNA
  • RNAseq
  • CAGE
  • Haloplex

Op de MiSeq sequencen we diverse amplicon en targeted sequencing projecten.

Wij doen projecten voor zowel afdelingen binnen en buiten het VUMC. Indien u een project heeft waarbij u wilt sequencen op onze HiSeq2500s en MiSeq neem dan contact op via NGS-KlinGen@vumc.nl. We helpen u graag met het ontwikkelen, plannen en optimaliseren van uw project. In overleg kunnen we ook (een gedeelte van) de bioinformatica op ons nemen. Tevens kunnen we adviseren over het opwerken van DNA samples en het runnen van een pilot.

Contact
Afdeling Klinische genetica - VUmc, lab. Genoomdiagnostiek
Van der Boechorststraat 7, J-381
1081 BT Amsterdam
Telefoon (020) 444 5403
E-mail:  NGS-KlinGen@vumc.nl

printen